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        質粒
        發布時間:2010-04-22   點擊次數:5634次

        定義  質粒(plasmid)是細菌擬核裸露DNA外的遺傳物質,為雙股閉合環形的DNA,存在于細胞質中,質粒編碼非細菌生命所必須的某些生物學性狀,如性菌毛、細菌素、毒素和耐藥性等。質粒具有可自主復制、傳給子代、也可丟失及在細菌之間轉移等特性,與細菌的遺傳變異有關。

        特征

          是真核細胞細胞核外或原核生物擬核區外能夠進行自主復制的遺傳單位,包括真核生物的細胞器(主要指線粒體和葉綠體)中和細菌細胞擬核區以外的環狀脫氧核糖核酸DNA分子?,F在習慣上用來專指細菌大腸桿菌)、酵母菌放線菌等生物中細胞核或擬核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中常被用做基因的載體Vector。許多細菌除了擬核中的DNA外,還有大量很小的環狀DNA分子,這就是(plasmid)(補充:部分為RNA)。上常有抗生素的抗性基因,例如,四環素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些稱為附加體(episome),這類能夠整合進真菌的染色體,也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。在宿主細胞體內外都可復制!

          目前,已發現有的細菌有幾百種,已知的絕大多數的細菌都是閉合環狀DNA分子簡稱cccDNA)。細菌的相對分子質量一般較小,約為細菌染色體的0.5%3%。根據相對分子質量的大小,大致上可以把分成大小兩類:較大一類的相對分子質量是40×106以上,較小一類的相對分子質量是10×106以下少數的相對分子質量介于兩者之間。每個細胞中的數主要決定于本身的復制特性。按照復制性質,可以把分為兩類:一類是嚴緊型,當細胞染色體復制一次時,也復制一次,每個細胞內只有12個;另一類是松弛型,當染色體復制停止后仍然能繼續復制,每一個細胞內一般有20個左右。這些的復制是在寄主細胞的松弛控制之下的,每個細胞中含有10-200份拷貝,如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質的合成還會使拷貝數增至幾千份。如較早的pBR322即屬于松弛型,要經過氯霉素處理才能達到更高拷貝數。一般分子量較大的屬嚴緊型。分子量較小的屬松弛型。的復制有時和它們的宿主細胞有關,某些在大腸桿菌內的復制屬嚴緊型,而在變形桿菌內則屬松弛型。

        培養

          在基因工程中,常用人工構建的作為載體。人工構建的可以集多種有用的特征于一體,如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。常用的人工運載體pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環素基因(Tcr)和抗氨芐青霉素基因(Apr),并含有5種內切酶的單一切點。如果將DNA片段插入EcoRI切點,不會影響兩個抗生素基因的表達。但是如果將DNA片段插入到Hind III、Bam H I Sal I切點,就會使抗四環素基因失活。這時,含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細菌抗氨芐青霉素,但對四環素敏感。沒有DNA插入片段的pBR322會使宿主細菌既抗氨芐青霉素又抗四環素,而沒有pBR322的細菌將對氨芐青霉素和四環素都敏感。pSC101pBR322相似,只是沒有抗氨芐青霉素基因和PstI切點。運載體的zui大插入片段約為10 kb(kb表示為千堿基對。

          1973年,科學家將作為基因的載體使用,為基因工程的誕生奠定了基礎。

          zui常用的是大腸桿菌的。這種常含有抗生素抗性基因,例如,卡那霉素抗性基因。

          pBR322

          pBR322DNA分子的長度為4363bp,此載體中有兩個標記基因,一個是氨芐青霉素抗性基因(Apr),另一個是四環素抗性基因(Tetr)?,F在已知pBR322DNA分子共有24種核酸內切限制酶的單一識別位點。其中7種限制酶(從1200位置按順時針方向)即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaIIINruI的識別位點位于四環素抗性基因內部,另

          外有2 種限制酶即ClaIHindIII的識別位點是存在于這個基因的啟動區內,在這9個限制位點上插入外源DNA都會導致tetr的失活。3種限制酶即ScaI、PvuIPstI的識別位點位于氨芐青霉素抗性基因內,在這些位點插入外源DNA則會導致ampr基因的失活。由pBR322載體的結構可知其具有如下優點:(1)具有較小的分子量。經驗表明,為了避免在DNA的純化過程中發生鏈的斷裂,克隆載體的分子大小不要超過10Kb。pBR322這種小分子量的特點,不僅易于自身DNA的純化,而且可容納較大的外源DNA片段;(2)具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號,能指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞以及外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。標記基因往往可以賦予宿主細胞一種新的表型,這種轉化細胞可明顯地區別于非轉化細胞。當我們把一個DNA片段插入到某一個標記基因內時,該基因就失去了相應的功能。當把這種重組DNA分子轉到宿主細胞后,該基因原來賦予的表型也就消失了。要是仍保留了原來表型的轉化細胞,細胞內含有的DNA分子一定不是重組子。很顯然,既要指示外源DNA是否進入了宿主細胞,又要指示載體DNA分子中是否插入了外源DNA片段,那么這種載體必須至少具有兩個標記基因。另外,pBR322載體還具較高的拷貝數,而且經過氯霉素擴增之后,每個細胞中可積累1000~3000個拷貝,這就為重組體DNA的制備提供了極大的方便。

        pBR322載體的構建

          pBR322載體的構建過程可簡單地概括如下:

          1、由于pBR322的親本之一是pMB1,故首先以pMB1為基礎,引入Rldrd19Tn3易位子,得到13.3kbpMB3;

          2、pMB3的分子量顯然使得它不適合作為載體,所以要通過在EcoRI活性條件下的消化讓它大部分的無用片段失去,留下來的小片段的DNA的黏性末端連接起來后就形成了pMB82.6kb);

          3、此時,另外一種pSC101EcoRI活性條件下消化產生了含有tetr抗性的DNA片斷,這個片斷和pMB8整合在一起就形成了pMB95.3kb)。此時pMB9ampstetr表型;

          4、pMB9已經初步具備載體的功能,為了讓它更加完善,我們要讓它具備amprtetr性能,即在pMB9上引入pSF2124Tn3易位子,但Tn3可以來也可以走,為了留住它,我們切去了Tn3中表達轉位酶的基因,形成了pBR313。

          此后我們兵分兩路:一路把pBR313PstI位點除去,使之成為ampstetr表型的pBR318;

          5、;另一路把pBR313EcoRII的位點切除,使之成為amprtets表形的pBR320。

          由此我們的到了兩種功能互補的,這樣我們只要將他們雜交就可以得到一種接近的載體了,這就是pBR322 。

        pBR322的應用

          了解了pBR322的結構和它的構建過程之后,我們來看pBR322在基因工程中的應用。

          pBR322作為一種常用的基因克隆載體,在實際應用中有著非常重要的地位,其中一個突出的例子就是應用pBR322 作為克隆載體對水稻的葉綠體光誘導基因psbA 進行結構分析。

          將水稻葉綠體的DNA,用EcoRI核酸限制性內切酶消化之后,放入含有溴化乙錠的低熔點(LMP)的1%瓊脂糖凝膠中作電泳分離。從LMP中分離出分子大小為1.82.5kb之間的DNA片段,再與同樣經過了EcoRI核酸限制性內切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理的pBR322連接。然后,將混合物轉化到大腸桿菌5346菌株,培養在氨芐青霉素選擇平板上,形成Ampr轉化子菌落群體。這樣就構成了由EcoRI核酸限制性內切酶切割的水稻葉綠體DNA基因組庫。用Ampr轉化子菌落與32P放射性標記的玉米psbA DNA 探針作菌落雜交,可以分離出其中的陽性克隆體。從這些陽性克隆體中分離出來的重組體DNA,經過進一步的分析,就能測出水稻葉綠體基因psbA的序列。

          利用pBR322作為載體重組人體的抑生長激素也是一個經常提到的應用例子。其過程和水稻葉綠體基因重組大同小異,只是除了在載體上插入抑生長激素基因外,還將含有lac操縱子起始部分的片段(包括啟動子、操縱區、核糖體結合位點和β-半乳糖苷酶的主要部分)插在抑生長激素基因的旁邊。由于有了lac操縱子的控制,重組基因產生的蛋白質的調節就變得比較容易了。

         

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